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細(xì)胞凍存和復(fù)蘇實(shí)驗(yàn)

更新時(shí)間:2022-09-01點(diǎn)擊次數(shù):2262

實(shí)驗(yàn)方法原理

       細(xì)胞凍存和復(fù)蘇的基本原理是慢凍快解凍,已被證明能最大限度地提高細(xì)胞活力。目前常用甘油或二甲基亞砜作為細(xì)胞低溫保存的保護(hù)劑。這兩種物質(zhì)可以提高細(xì)胞膜對(duì)水的滲透性,再加上緩慢的冷凍可以使細(xì)胞內(nèi)的水從細(xì)胞中滲出,減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成,從而減少冰晶形成對(duì)細(xì)胞的損傷。復(fù)蘇細(xì)胞時(shí)應(yīng)采用快速熔融的方法,以保證細(xì)胞外晶體在短時(shí)間內(nèi)熔融,以避免因水緩慢熔融進(jìn)入細(xì)胞形成細(xì)胞內(nèi)重結(jié)晶而對(duì)細(xì)胞造成損傷。


實(shí)驗(yàn)材料:細(xì)胞


試劑、試劑盒:

       D-Hanks液 、小牛血清 、培養(yǎng)液、 青霉素、 鏈霉素、 胰蛋白酶、 HCl 、NaHCO3、 DMSO、 甘油


儀器、耗材:

微量加樣槍、吸頭、 離心管、 凍存管 、槍頭、 膠塞 、移液管玻璃瓶、 紅血球計(jì)數(shù)板、 記號(hào)筆、 醫(yī)用橡皮膏 、移液槍 、超凈工作臺(tái) 、離心機(jī) 、恒溫水浴箱、 冰箱、 倒置相差顯微鏡 、培養(yǎng)箱 、液氮冰箱


實(shí)驗(yàn)步驟:

1、細(xì)胞凍存

①10%DMSO或甘油冷凍培養(yǎng)基的制備10~20%小牛血清。

② 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用胰蛋白酶消化,懸液中生長(zhǎng)的細(xì)胞直接移到15 ml離心管。

③離心機(jī)轉(zhuǎn)速1000轉(zhuǎn),5分鐘。

④除去胰蛋白酶和舊培養(yǎng)基,加入適量配制好的冷凍培養(yǎng)基。用吸管輕輕吹氣使細(xì)胞均勻、計(jì)數(shù),調(diào)整凍液中細(xì)胞的最終密度為5×106/ml~1×107/ml。

⑤細(xì)胞分成深低溫保存管,每管1~1.5ml。

⑥低溫保存管上標(biāo)明細(xì)胞名稱、冷凍時(shí)間和操作人員。

⑦冷凍:標(biāo)準(zhǔn)的冷凍程序是冷卻速度為-1~-2°C/min。溫度低于-25℃時(shí),可提高到-5°C~-10°C / min.。在-100℃時(shí),可快速浸入液氮中。含有細(xì)胞的冷凍保存管也可以放在-20°C的冰箱里2個(gè)小時(shí),然后放入-70°D的冰箱中過夜。取出冷凍管并將其移到液氮容器中。

2、細(xì)胞復(fù)蘇:

①將冷凍管從液氮容器中取出,直接浸入37°C溫水中,并不時(shí)搖晃,使其盡快融化。

②從37°C水浴中取出凍存管,打開蓋子,用移液器吸出細(xì)胞懸液,加入離心管滴下培養(yǎng)液10倍以上,攪拌均勻。       

③離心,1000轉(zhuǎn)/分鐘,5分鐘。

④棄去上清液,加入10%小牛血清培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞,計(jì)數(shù),調(diào)整細(xì)胞密度,接種培養(yǎng)瓶,37°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

⑤第二天更換培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)。


注冊(cè)事項(xiàng):

①從增殖期到形成致密單層細(xì)胞的培養(yǎng)細(xì)胞可用于低溫保存,但優(yōu)選對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。冷凍前一天最好換培養(yǎng)基。

②將冷凍儲(chǔ)存管放入液氮容器或取出時(shí),要做好防護(hù)工作,避免凍傷。。

③冷凍復(fù)蘇時(shí),最好使用新配制的培養(yǎng)基。






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